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干货分享｜深度解析AAV载体在基因治疗中的原理、实践与前景

发布时间：2025-06-11 16:43分类：健康浏览：129评论：0

导读：基因治疗的成功高度依赖于高效、安全的基因递送系统。当前基因治疗主要依赖于两类基因递送系统：病毒载体与非病毒载体。病毒载体，如腺相关病毒（AAV）和慢病毒，因具备天然的细胞侵染能力，...

基因治疗的成功高度依赖于高效、安全的基因递送系统。当前基因治疗主要依赖于两类基因递送系统：病毒载体与非病毒载体。病毒载体，如腺相关病毒（AAV）和慢病毒，因具备天然的细胞侵染能力，能够实现高效的基因递送；相比之下，非病毒载体，如脂质纳米颗粒、阳离子聚合物，虽在免疫原性控制与成本方面具有一定优势，但在递送效率、细胞存活率及靶向能力等方面仍存在一定局限。

在众多病毒载体中，AAV因其低致病性与低免疫原性、广泛的细胞感染能力以及长期稳定表达外源基因的特性，成为最具潜力的载体之一。AAV递送的基因组通常以附加体形式存在，不整合入宿主细胞基因组，从而显著降低了插入性突变的风险，提高了治疗的安全性。

近日，伦敦大学学院的Emad Moeendarbary等人的团队在Viruses发表了题为“Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy”的综述文章，系统梳理了AAV载体在基因治疗中的基本原理、生产工艺和临床应用等。本文将结合该综述中的核心观点，对AAV基因治疗的结构基础、递送机制及应用实践进行深入解析，旨在与大家共同学习及探讨这一热门载体的研究现状与未来趋势。

一、AAV的结构和功能

1. AAV的结构组成及其关键组分

野生型AAV是一种无包膜小型病毒，隶属副粘病毒科，直径约25纳米。其基因组为一条约4.7千碱基的单链DNA，包裹在由60个亚单位组成的二十面体衣壳中。衣壳包含三种蛋白（VP1、VP2、VP3），负责结构稳定、受体结合、细胞进入及DNA包装。此外，AAV编码四种非结构复制蛋白（Rep78、Rep68、Rep52、Rep40），调控病毒复制、转录及基因组包装，以及一个组装激活蛋白（AAP），为衣壳组装提供支架。

AAV的基因组两侧是两个反向重复序列（ITRs），在宿主基因组整合、载体生产和持续细胞转导中起关键作用。目前已发现超过100种AAV自然变体及多种血清型，感染通常无害且无症状。由于自身复制缺陷，AAV需要与辅助病毒（如腺病毒或单纯疱疹病毒）共感染才能进行复制。

图1 野生型AAV、单链重组AAV和自互补型AAV的结构

2. 重组AAV（rAAV）的设计与应用

重组腺相关病毒（rAAV）旨在实现长期基因表达，并最大程度减少染色体整合，以保护宿主基因组的完整性。在rAAV系统中，大部分病毒基因组，包括rep和cap基因，被一个表达盒所取代。该表达盒含有目的基因（GOI），两侧为ITR序列，前端有启动子启动表达，下游的polyA尾可增强mRNA稳定性，促进高效翻译。

这种设计使得rAAV无法自行复制，需外部提供衣壳和rep基因，安全性高，特别适合在单次感染后传递和维持转基因表达。

3. 自我互补型AAV（scAAV）的突破性改进

传统单链AAV在宿主细胞核内，需经历从单链DNA（ssDNA）到双链DNA（dsDNA）的转化过程，这一步骤限制了转导效率。为此，研究者开发出自我互补型 AAV（scAAV），通过改变5'端ITR，使基因组折叠成双链结构，直接跳过宿主细胞的DNA合成步骤。这一结构改变显著提升了转导效率，相比传统单链AAV，效率可能提高十倍甚至更多。

4. AAV的细胞转导路径与优化策略

AAV感染和转导细胞是一系列有序的过程。AAV首先通过衣壳蛋白与宿主细胞表面受体结合，随后经内吞作用进入细胞。接着，病毒颗粒从核内体逃逸，转运至细胞核，释放出ssDNA并转化为dsDNA，最终启动治疗基因的表达。

图2 AAV转导路径

研究发现，对AAV载体设计进行针对性修改，可显著提高转导效率。例如，对AAV2和AAV6衣壳蛋白进行磷酸化修饰（如Thr→Val突变），能够显著增强核转运效率。

5. AAV递送方法的组织嗜性选择

AAV的递送方式会直接影响其组织分布和治疗效果。常见的递送方法包括静脉注射（IV，全身分布）、鞘内注射（IT，靶向中枢神经系统）、肌肉注射（IM，局部表达）、眼内注射（视网膜疾病）、腹腔注射（动物模型）等。每种方法都各有优劣，具体可以参考表1。

表1 AAV递送方法总结

二、AAV血清型与组织嗜性

1. AAV血清型的多样性

目前已知的AAV血清型超过13种，天然变体超过100种。不同血清型通过与特定细胞表面受体结合，表现出独特的组织嗜性（tropism），即“因症选型”。例如，AAV1的衣壳蛋白缺乏肝素结合位点，使其在基因治疗中具独特优势，能高效转导多种组织，包括骨骼肌、心脏、中枢神经系统（CNS）和视网膜，常用于肌肉疾病（如杜氏肌营养不良症）和心血管疾病治疗。

AAV7、AAV8和AAV9在肝脏、骨骼肌和心肌中趋向性强，尤其是AAV9，因其能穿越血脑屏障（BBB），在神经学领域应用广泛。这种组织嗜性让AAV能精准靶向病变组织，降低对非靶组织的影响。

表2 AAV不同血清型概述

2. 工程化改造：超越天然血清型的限制

在为基因治疗选择AAV血清型时，需要综合考虑靶组织特性、基因表达强度及持续时间等因素。研究者通过开发嵌合、杂交及组合式载体库等创新工程改造，成功构建出具有优化靶向特异性、转导效率及安全性的新型杂合载体和血清型。

此外，还有通过对衣壳进行特定位点修饰来改进组织靶向性或改变抗原位点的合理设计方法，以及通过选择性压力的迭代选择过程生成衣壳库，并分离出具有特定所需特征的变体。

三、AAV的生产工艺

重组AAV的大规模生产，即高效产出高纯度的rAAV颗粒，是临床应用的核心需求。随着更多基因疗法获批，商业化生产需求不断攀升，但规模化生产仍面临重大挑战。因此，开发既能提升产率和转导效率，又能减少空壳颗粒污染的生产策略至关重要。

图3 AAV载体生产流程

1. 上游工艺

临床前研究的AAV生产主要靠贴壁培养的HEK293细胞，然而这种传统方法需要大量培养瓶，导致空间、人力和成本呈指数级增长，且难以符合GMP标准。悬浮HEK293细胞培养体系则具有明显优势，细胞可在无动物成分、无抗生素的培养基中生长，能够高产率获取高纯度的AAV颗粒，培养基成分简单，分析要求低且安全性高。

基于HeLa细胞的稳定细胞系是另一种高效生产rAAV颗粒的方法。其中的包装细胞系可以通过两种方式产生rAAV：一种是转染AAV构建体并共感染腺病毒辅助病毒，另一种是感染重组的Ad/AAV杂合辅助病毒。而生产细胞系则包含AAV的rep/cap基因和rAAV基因组，仅需一步感染腺病毒辅助病毒即可进行生产。

目前的业界正致力于优化AAV生产的上游工艺，提高产量并减少空衣壳产生。比如通过调整三质粒共转染方案中质粒的比例，微调生产过程中的参数（如pH值、温度和离子强度），寻找能够促进rAAV生产的小分子化学添加剂，或者构建杂合rep基因等等。

2. 下游纯化

下游纯化是AAV生产的关键环节，其目的是获得高产量、高效能和高纯度的最终产品。rAAV纯化需要精准分离细胞和病毒杂质，去除空衣壳，同时保持病毒颗粒的活性与稳定性。不同血清型AAV的纯化策略需结合特定技术，并适配生产规模。总体而言，纯化应制备出高纯度的所有AAV血清型载体，使完整颗粒比例大于90%。

表3 AAV纯化技术对比

3. 分析鉴定

评估AAV终产品质量的好坏涉及到病毒基因组的滴度、感染活性（效价）、纯度（空衣壳比例、宿主细胞及质粒DNA残留、蛋白污染物）、稳定性（聚集倾向）以及衣壳蛋白、基因组和治疗基因的分子特征（结构完整性与表达/功能活性）。

过去15年里，质谱（MS）是分析AAV衣壳完整性及杂质的核心工具，但其应用受限于样本体积和设备要求。差示扫描荧光技术（DSF）通过SYPRO Orange染料监测衣壳热稳定性（Tm），兼具高通量与成本优势。

AAV样本当中内毒素和宿主蛋白的污染也会直接影响临床安全性。最新纯化方案已实现将内毒素水平降至检测限度以下，且不影响病毒功能及衣壳完整性。宿主蛋白共洗脱现象同样是技术难点，但并非所有宿主杂质均具负面效应——某些成分甚至可能增强转导活性。因此，纯化策略需辩证评估共洗脱蛋白的功能影响。

四、AAV基因治疗的临床应用

AAV基因治疗的临床研究发展迅速。截至目前，全球已完成及在研的AAV基因治疗临床试验超过300项，覆盖55种疾病的治疗。早期临床探索始于2000年，首个AAV载体（AAV2）的I期临床试验针对囊性纤维化患者开展，旨在评估其安全性及疗效。

1. 临床突破：六大获批疗法

2017年，Luxturna成为美国FDA批准的首个AAV眼科基因疗法。此后，2019年Zolgensma获批，开创了脊髓性肌萎缩症的基因治疗新纪元。2023年，FDA批准了七款基因疗法，其中Sarepta的Elevidys成为首个获批治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的AAV疗法，适用于可自主活动的儿童患者；2024年4月，辉瑞的BEQVEZ™获批用于成人B型血友病的一次性基因治疗。这些重要突破推动着基因治疗领域不断向前发展。